Zgodnie z zapisami „Ustawy o fundacji – Zakład Narodowy imienia Ossolińskich” głównymi celami działalności Ossolineum jest utrzymywanie i pomnażanie zbiorów Narodowej Biblioteki Ossolineum oraz Muzeum Książąt Lubomirskich, a także ich opracowywanie i upowszechnianie, utrzymywanie i pomnażanie dóbr kultury polskiej, wspieranie i prowadzenie prac naukowo-badawczych oraz działalność wydawnicza.
Zbiory Ossolineum powiększane są poprzez zakupy, ale wzbogacają je także cenne dary wielu osób i instytucji. Z największych donacji ostatnich lat warto przypomnieć kolekcję map śląskich dr. Tomasza Niewodniczańskiego, kolekcję monet i medali Stefana Garczyńskiego; księgozbiory m.in.: Eustachego Sapiehy, Władysława Bartoszewskiego, Ryszarda Kuklińskiego, cenne archiwa rękopiśmienne np.: Jana Nowaka-Jeziorańskiego, Tadeusza Żenczykowskiego, Władysława Bartoszewskiego, Stanisława Vincenza, Marii i Jerzego Kuncewiczów czy Jerzego Grotowskiego. W oparciu o dary przekazywane przez
prof. W. Bartoszewskiego i Jana Nowaka-Jeziorańskiego, utworzono w Zakładzie dwa Gabinety Świadków Historii pod patronatem każdego z darczyńców. Przekazany w roku 2016 księgozbiór i spuścizna rękopiśmienna Tadeusza Różewicza stanie się podstawą do utworzenia trzeciego z gabinetów.
Ossolińskie zbiory liczą obecnie blisko 2.000.000 jednostek. Udostępniane są
w 9 czytelniach, dysponujących 156 miejscami. W trosce o zachowanie najcenniejszych zbiorów, szczególnie rękopisów i starych druków, od 2007 r. realizowanych jest wiele projektów wspierających konserwację i digitalizację zbiorów. Ossolineum współpracuje w tych projektach m. in. z Ministerstwem Kultury i Dziedzictwa Narodowego, Urzędem Marszałkowskim Województwa Dolnośląskiego oraz Mechanizmem Finansowym EOG i Norweskim Mechanizmem Finansowym. Od 2006 Biblioteka Ossolineum należy też do konsorcjum Dolnośląskiej Biblioteki Cyfrowej, udostępniając w jej zasobach ponad 10.000 obiektów online. Użytkownikom Zakładu oferowana jest także pomoc w poszukiwaniu informacji i zbiorów oraz usługi reprograficzne. Znaczna część zbiorów Biblioteki Ossolineum (w tym tzw. zbiory lwowskie) należy do Narodowego Zasobu Bibliotecznego, otaczanego szczególną ochroną.
Prowadzona przez Ossolineum działalność naukowo-badawcza to przede wszystkim naukowe opracowanie zbiorów, prace dotyczące dziejów Ossolineum, publikowanie własnego periodyku naukowego (od 1991 pt. „Czasopismo ZNiO”) czy współpraca z innymi instytucjami naukowymi (m.in. od 2017 r. Ossolineum jest członkiem Oksfordzkiego Towarzystwa Bibliograficznego). Ossolineum bierze też udział w corocznym Dolnośląskim Festiwalu Nauki. Działania naukowe Ossolineum opiniuje i wspiera Rada Naukowa.
Zakład prowadzi działalność wystawienniczą – organizując zarówno duże wystawy w reprezentacyjnych salach Pod Kopułą czy Auli Ossolineum, jak i liczne wystawy planszowe poświęcone niezwykłym wydarzeniom z dziejów Ossolineum czy szczególnie interesującym rodzajom zbiorów. Wystawy planszowe prezentowane są w urokliwym ogrodzie barokowym lub w przestrzeni miejskiej, np. na wrocławskim Rynku.
Ważnym elementem bieżącej działalności jest szeroka oferta edukacyjna i kulturalna – m. in. cykliczne wykłady dotyczące historii i zbiorów Ossolineum, a w roku jubileuszowym także niezwykle interesujący cykl „Moje spotkania z Ossolineum”, w którym najbardziej znane postaci wrocławskiej nauki, kultury, mediów
i polityki opowiadają o swoich ossolińskich doświadczeniach.
Prężnie rozwijana jest także działalność wydawnicza – Wydawnictwo Ossolineum publikuje współczesną eseistykę i prozę, klasykę literatury, m.in. w serii „Biblioteka Narodowa”, literaturę naukową
i popularnonaukową, a także prace związane z historią i bieżącą działalnością Ossolineum.
Ossolineum, w maju 2016 r. uruchomiło Muzeum „Pana Tadeusza”, które mieści się na wrocławskim Rynku, w Kamienicy pod Złotym Słońcem. Prowadzi ono działalność kulturalną, naukowo-badawczą, edukacyjną i popularyzatorską związaną najważniejszym eksponatem – rękopisem Mickiewiczowskiego „Pana Tadeusza” oraz innymi obiektami pochodzących ze zbiorów Ossolineum, a także wypożyczonymi z placówek muzealnych w kraju i za granicą. W Muzeum organizowane są wystawy czasowe, koncerty, przedstawienia teatralne, spotkania i festiwale literackie, pokazy filmowe oraz dyskusje, konferencje naukowe. Rdzeniem merytorycznym Muzeum jest rozbudowany, wieloaspektowy, innowacyjny program edukacyjny.
Wyjątkowym elementem działalności Ossolineum jest współpraca z instytucjami lwowskimi, szczególnie z Lwowską Narodowa Naukową Biblioteką Ukrainy im. V. Stefanyka. Od 2004 r. Ossolineum prowadzi program digitalizacji polskich kolekcji przechowywanych w Lwowskiej Narodowej Naukowej Biblioteki Ukrainy im. V. Stefanyka (przede wszystkim przedwojennych ossolińskich kolekcji rękopiśmiennych oraz zbioru prasy polskiej z lat 1801-1939). W 2006 powołany został pełnomocnik Ossolineum we Lwowie, którego zadaniem jest m. in. koordynacja projektów digitalizacji, współpraca ze wszystkimi instytucjami, do których trafiły dawne zbiory Zakładu, a także organizacja, od 2006 r., pod patronatem Konsula Generalnego RP we Lwowie i we współpracy z stroną ukraińską, „Spotkań Ossolińskich” z intersującymi ludźmi nauki, kultury i polityki (do tej pory odbyło się 68 spotkań).
